雜交瘤細胞的雜交常用的檢測方法

　　抗體檢測

　　用檢測抗體的方法從雜交細胞中篩選出生產指定抗體的雜交株是很重要的。檢測抗體的瘤細方法很多，從沉淀反應到放射免疫測定。常用測方由于細胞培養液中的雜交抗體濃度通常是很低的，而且傳統的瘤細檢測方法多是以多價抗原與多克隆抗血清相反應。雜交瘤產生的常用測方抗體則是單克隆的，所以并不是雜交每項方法都能適用。一定要選擇敏感的瘤細、快速的常用測方、一次又能檢測多份樣品的雜交方法。常用的瘤細檢測方法如下：

　　1.試管溶血反應檢測法

　　(1)材料：①雜交瘤細胞，換液后至少兩天才收取培養液;②綿羊紅血球，常用測方洗滌三次后，雜交配成1%懸液;③豚鼠補體，瘤細無菌采取補體，常用測方以pH7.2PBS稀釋成20%溶液，分裝小瓶，于﹣40℃保存。使用時以補體和壓積紅血球5:1(V/V)的量進行吸收，4℃30min，然后2 000r/min離心10min，去紅血球，取上清液備用;④0.01Mol/L pH7.2PBS液。

　　(2)操作方法：①在小試管中，加入0.1ml雜交瘤細胞用過的培養液，再加入0.1ml pH7.2的PBS液，然后倍比稀釋至一定的稀釋度;②加入0.1ml補體和1%綿羊紅血球0.1ml，混勻后置37℃水浴1h;③觀察結果，以綿羊紅血球完全溶解的雜交瘤細胞培養液的最高稀釋倍數為抗體的溶血效價。

　　2.斑點檢測法 抗紅血球表面的單克隆抗體與澆灌在瓊脂板的紅血球結合，進而結合補體，而發生溶血斑點，對著光源用肉眼即可判定。

　　(1)材料：①綿羊紅血球，處理同試管法，最后配成25%紅血球懸液;②新鮮豚鼠血清(同試管法處理);③瓊脂糖，配成0.6%PBS液，水浴中溶化;④0.01Mol/L pH7.2PBS液;⑤兔抗羊紅血球抗體。

　　(2)操作方法：①將溶化的0.6%瓊脂糖倒入一試管中，置45℃～48℃水浴中;②加0.1ml 25%紅血球懸液，0.1ml豚鼠補體，迅速混勻，傾注一干凈載玻片上;③ 凝固后，在凝膠表面固定區域滴加2ml待測樣品，標準陽性血清和對照試液;④待溶液全部滲入凝膠后，置濕盤;⑤37℃溫育1h～2h，觀察并判定結果。

　　強陽性(+++) 中等陽性(++)

　　弱陽性(+) 陰性(﹣)

　　必要時可置室溫過夜，再判定一次。

　　3.膜熒光檢測法

　　(1)材料：①培養液HEM或RPMI-1640;②熒光試劑：異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗小鼠免疫球蛋白;③50%甘油緩沖液：1份甘油加1份體積0.05Mol/L pH 7.2 PBS 液混合即成;④熒光顯微鏡、載玻片、蓋玻片、吸管等。

　　(2)操作方法：①用培養液洗滌二次細胞，懸浮成2.0×107/ml;②50µl細胞懸液加50μl培養上清液混合，置4℃30min，用培養液洗滌3次，1 000r/min離心;③以50µlFITC—抗小鼠免疫球蛋白重新懸浮壓積細胞，水浴30min～60min;④用冷培養液洗3次細胞，重新懸浮;⑤取一滴細胞懸液滴在玻片上，復蓋片，用甘油緩沖液封固，置熒光顯微鏡下觀察。著色細胞也可以在固定后觀察，一滴細胞懸液，涂片、風干，用95%酒精固定10min，固定后的載玻片用PBS洗滌，蓋上蓋玻片，進行觀察。

　　4.免疫球蛋白和亞類球蛋白的檢測 以瓊脂雙擴散試驗法進行，此法簡單易操作，特異性好。注意必須將培養液濃縮10～50倍，否則做雙向瓊擴不出現沉淀線。其檢測方法為：

　　(1)制備各種兔抗小鼠IgG1~4、 IgM1~2、IgA1~2和K、λ抗血清,也可直接購買。

　　(2)取5ml培養物的上清液緩慢加入0.5ml的飽和硫酸銨溶液，混勻，靜置3h，離心沉淀，去上清，沉淀加0.05ml蒸餾水溶解。

　　(3)制成1%瓊脂糖凝膠板，打孔。中間孔加20μl濃縮上清液，周圍孔加20µl特異性抗血清，以10μl正常小鼠血清作對照。

　　也可以采用酶聯免疫吸附試驗、間接血凝試驗以及放射免疫等方法檢測。

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