雙抗體夾心法操作步驟

　　雙抗體夾心法

　　1.　包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg/ml。雙抗在每個聚苯乙烯板的體夾反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃ 過夜。心法次日，操作棄去孔內(nèi)溶液，步驟用洗滌緩沖液洗3次，雙抗每次3分鐘。體夾(簡稱洗滌，心法下同)。操作

　　2.　加樣：加一定稀釋的步驟待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃ 孵育1小時。雙抗然后洗滌。體夾(同時做空白孔，心法陰性對照孔及陽性對照孔)。操作

　　3.　加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，步驟加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小時，洗滌。

　　4.　加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘。

　　5.　終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。

　　6.　結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

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