文 | 科志康 原創(chuàng)|雙胍

基因治療領(lǐng)域正在以指數(shù)級(jí)的解讀基因速度發(fā)展。一些基因治療產(chǎn)品現(xiàn)已在全球多個(gè)地區(qū)獲得批準(zhǔn)，治療大量基因治療產(chǎn)品正在開發(fā)中。產(chǎn)品開展生物分布研究被認(rèn)為是臨床基因治療產(chǎn)品非臨床計(jì)劃的重要組成部分。基因治療數(shù)據(jù)對(duì)于支持早期臨床試驗(yàn)中的生物產(chǎn)品管理和安全監(jiān)測(cè)是必要的。

2019年6月，分布ICH認(rèn)可了ICH S12基因治療產(chǎn)品的考慮非臨床生物分布考慮主題。2021年6月3日ICH批準(zhǔn)了ICH S12的解讀基因草案版本，預(yù)計(jì)最終定稿將于2023年6月頒布實(shí)施。治療S12是產(chǎn)品第一個(gè)針對(duì)基因治療產(chǎn)品非臨床開發(fā)的ICH指南，為非臨床生物分布研究的臨床設(shè)計(jì)優(yōu)化提供了參考，促進(jìn)基因治療產(chǎn)品的生物非臨床和臨床開發(fā)。

1、分布簡(jiǎn)介

1.1. 目標(biāo)

本指南旨在為基因治療（GT）產(chǎn)品開發(fā)中的考慮非臨床生物分布（BD）研究提供統(tǒng)一建議。本文件為非臨床BD評(píng)估的解讀基因總體設(shè)計(jì)提供建議，以及提供BD數(shù)據(jù)的解釋和應(yīng)用考慮，用于支持非臨床開發(fā)計(jì)劃和臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)。本指南中的建議旨在促進(jìn)GT產(chǎn)品的開發(fā)，同時(shí)根據(jù)3R原則（減少/完善/替換）避免不必要的動(dòng)物使用。

1.2. 背景

了解GT產(chǎn)品體內(nèi)給藥后的BD概況是非臨床開發(fā)計(jì)劃的一個(gè)重要內(nèi)容。BD數(shù)據(jù)有助于解釋和設(shè)計(jì)非臨床藥理學(xué)和毒理學(xué)研究，以支持目標(biāo)人群的早期臨床試驗(yàn)。盡管各國(guó)監(jiān)管機(jī)構(gòu)已發(fā)布了包含BD研究建議的指南，但本文件為非臨床BD提供了統(tǒng)一的定義，并傳達(dá)了評(píng)估GT產(chǎn)品BD的總體考慮因素。

1.3. 范圍

本指南范圍內(nèi)的GT產(chǎn)品包括通過轉(zhuǎn)移的遺傳物質(zhì)表達(dá)（轉(zhuǎn)錄或翻譯）來調(diào)節(jié)其作用的產(chǎn)品，包括純化核酸（例如質(zhì)粒和RNA）、經(jīng)基因修飾以表達(dá)轉(zhuǎn)基因的微生物（例如病毒、細(xì)菌、真菌，包括編輯宿主基因組的產(chǎn)品）和體外轉(zhuǎn)基因人類細(xì)胞。本指南還涵蓋旨在體內(nèi)改變宿主細(xì)胞基因組而無需特定轉(zhuǎn)錄或翻譯（即通過非病毒方法傳遞核酸酶和向?qū)NA）的產(chǎn)品。雖然某些地區(qū)目前尚未考慮GT，但本指南中概述的原則也適用于未經(jīng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的溶瘤病毒。本指南不適用于預(yù)防性疫苗，也不包括未使用基于生物技術(shù)的制造工藝生產(chǎn)的化學(xué)合成寡核苷酸或其類似物。GT產(chǎn)品通過排泄物（糞便）、分泌物（尿液、唾液、鼻咽液等）或通過皮膚（膿皰、潰瘍、傷口）釋放到體外被稱為“脫落”。GT產(chǎn)品非臨床脫落情況的評(píng)估不在本指南的范圍內(nèi)。GT產(chǎn)品的基因組整合和種系整合評(píng)估也不在本指南的范圍內(nèi)。

2、非臨床BD的定義

BD是GT產(chǎn)品在相關(guān)動(dòng)物物種中的給藥部位以及靶組織和非靶組織（包括生物流體，如血液、腦脊液、玻璃體液）中的體內(nèi)分布、持續(xù)和清除。非臨床BD研究需要使用分析方法來檢測(cè)收集樣本中的GT產(chǎn)品和被轉(zhuǎn)移的遺傳物質(zhì)，并可以包括檢測(cè)被轉(zhuǎn)移的遺傳物質(zhì)的表達(dá)產(chǎn)物的方法。

3、非臨床BD評(píng)估的時(shí)機(jī)

在非臨床研發(fā)早期階段獲得的初步BD數(shù)據(jù)可能有助于后續(xù)藥理學(xué)和毒理學(xué)研究的物種選擇（見第4.3節(jié)）。此外，在評(píng)估和解釋非臨床藥理學(xué)和毒理學(xué)發(fā)現(xiàn)時(shí)，應(yīng)提供BD數(shù)據(jù)。非臨床BD數(shù)據(jù)還可以為設(shè)計(jì)首次人體臨床試驗(yàn)提供信息（見第6節(jié)），因此，在臨床試驗(yàn)開始之前完成非臨床BD評(píng)估很重要。

4、非臨床BD研究設(shè)計(jì)

4.1.一般考慮

BD研究可以作為獨(dú)立的BD研究或與非臨床藥理學(xué)和毒理學(xué)研究結(jié)合進(jìn)行（見第5.3節(jié)）。因此，在本文件中，“BD研究”一詞表示兩種情況。在給藥代表擬用臨床產(chǎn)品的GT產(chǎn)品后，應(yīng)在相關(guān)動(dòng)物物種中進(jìn)行非臨床BD評(píng)估（見第4.3節(jié)，可能的替代方案見第4.2節(jié)）。重要的是，給藥途徑（ROA）應(yīng)盡可能反映預(yù)期的臨床ROA，并且所研究的劑量水平應(yīng)充分描述BD概況（見第4.5節(jié)）。

驗(yàn)證BD評(píng)估的數(shù)據(jù)質(zhì)量、完整性和可靠性非常重要。原則上，非臨床BD研究可以不符合良好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范（GLP）；然而，當(dāng)BD評(píng)估作為符合GLP的毒理學(xué)研究的一部分進(jìn)行時(shí)，所有生命參數(shù)和樣品采集程序符合GLP很重要。

4.2. 供試品

非臨床BD研究中使用的供試品應(yīng)代表預(yù)期的臨床GT產(chǎn)品，將制造工藝、重要產(chǎn)品特性（例如效價(jià)）和最終臨床配方（見第5.7節(jié)）納入考慮。某些情況下，由含不同治療性轉(zhuǎn)基因或表達(dá)標(biāo)記基因的臨床載體的GT產(chǎn)品生成的非臨床BD數(shù)據(jù)可用于支持BD概況（見第5.8節(jié)），例如，有熒光標(biāo)記蛋白表達(dá)盒的相同血清型和啟動(dòng)子的腺相關(guān)病毒載體。

【首個(gè)正式上市的mRNA疫苗Comirnaty（BNT162b2）就是用編碼熒光素酶的modRNA在小鼠中評(píng)估遺傳物質(zhì)的生物分布，用[3H]標(biāo)記的脂質(zhì)在大鼠中研究LNP的生物分布。】

4.3. 動(dòng)物種類或模型

BD評(píng)估應(yīng)在允許遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移和表達(dá)的相關(guān)動(dòng)物物種或模型中進(jìn)行。選擇因素可能包括組織趨性、基因轉(zhuǎn)移效率以及靶組織和非靶組織/細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的物種差異。如果使用有復(fù)制能力的載體，動(dòng)物物種或模型必須允許載體復(fù)制。

物種、性別、年齡、生理?xiàng)l件（即健康動(dòng)物或動(dòng)物疾病模型）對(duì)BD的影響也很重要。此外，應(yīng)考慮動(dòng)物物種對(duì)給藥載體和/或表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)生免疫反應(yīng)的可能性（見第5.4節(jié)）。從評(píng)估基因轉(zhuǎn)移效率的初步研究或分析方法中產(chǎn)生的BD數(shù)據(jù)可以幫助在后續(xù)研究中選擇合適的動(dòng)物物種進(jìn)行全面BD評(píng)估。

4.4. 動(dòng)物組別大小和性別

應(yīng)在每個(gè)預(yù)定的采樣時(shí)間點(diǎn)評(píng)估每種性別（如適用）的適當(dāng)數(shù)量的動(dòng)物，以生成支持全面BD評(píng)估的足夠數(shù)據(jù)（見第4.6節(jié)）。關(guān)于動(dòng)物數(shù)量的一般建議見注1。根據(jù)3R的原則，動(dòng)物總數(shù)可以是幾項(xiàng)研究的總和。應(yīng)為每個(gè)時(shí)間點(diǎn)評(píng)估的動(dòng)物數(shù)量以及使用多個(gè)研究的組合數(shù)據(jù)（如適用）提供理由。當(dāng)僅評(píng)估一種性別時(shí)，還應(yīng)提供理由。

注1：一般而言，建議每種性別/組/時(shí)間點(diǎn)至少評(píng)估5只嚙齒動(dòng)物或3只非嚙齒動(dòng)物；然而，為每種性別納入相等數(shù)量可能并不重要。需要為這些決定提供理由。

4.5. 給藥途徑和劑量水平選擇

GT產(chǎn)品的ROA會(huì)影響B(tài)D特征，包括轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞類型和免疫反應(yīng)。因此，在可行的情況下，應(yīng)使用預(yù)期的臨床ROA給藥GT產(chǎn)品（見注2）。

注2：對(duì)于使用的每個(gè)給藥裝置，重要的是提供數(shù)據(jù)以驗(yàn)證給藥GT產(chǎn)品在動(dòng)物體內(nèi)的體積和劑量水平。此信息可能會(huì)影響對(duì)BD結(jié)果的解釋。如果計(jì)劃在臨床試驗(yàn)中使用新型給藥裝置，考慮從使用該裝置或其等效物進(jìn)行的藥理學(xué)和/或毒理學(xué)研究中采集BD數(shù)據(jù)。

所給GT產(chǎn)品的選定劑量水平應(yīng)提供BD概況的充分特征，以幫助解釋藥理學(xué)和毒理學(xué)評(píng)估。最高劑量水平應(yīng)為毒理學(xué)研究中預(yù)期的最大劑量水平（通常受動(dòng)物大小、ROA/解剖目標(biāo)或GT產(chǎn)品濃度限制）。然而，如果有適當(dāng)?shù)睦碛桑A(yù)期最大臨床劑量水平也可以作為BD評(píng)估的最高劑量水平。

4.6. 樣本采集

目標(biāo)和非目標(biāo)組織及生物流體的樣本采集程序應(yīng)設(shè)計(jì)為將污染可能性降至最低。必須遵循預(yù)先規(guī)定的流程，包括對(duì)從每只動(dòng)物（溶媒對(duì)照組和給藥GT產(chǎn)品組）獲得的樣品進(jìn)行適當(dāng)歸檔，以及記錄樣品采集順序。樣本采集時(shí)間點(diǎn)應(yīng)反映給藥GT產(chǎn)品后，目標(biāo)和非目標(biāo)組織/生物流體中GT產(chǎn)品水平達(dá)到峰值、穩(wěn)態(tài)（即平臺(tái)）和下降（如可行）的預(yù)期時(shí)間。如適用，可包括其他時(shí)間點(diǎn)，以更全面地捕獲穩(wěn)態(tài)期長(zhǎng)度并估計(jì)持續(xù)性。如果適用，應(yīng)考慮包括重復(fù)給藥后的時(shí)間點(diǎn)，以便評(píng)估GT產(chǎn)品水平。

對(duì)于有復(fù)制能力的載體，樣本采集時(shí)間點(diǎn)還應(yīng)包括由于載體復(fù)制和隨后的清除階段而檢測(cè)到的第二峰值水平。

采集的樣本應(yīng)包括以下組織/生物流體：血液、注射部位、性腺、腎上腺、腦、脊髓（頸、胸、腰）、肝、腎、肺、心臟和脾臟，并可根據(jù)其他考慮因素進(jìn)行擴(kuò)展，如載體類型/趨性、表達(dá)產(chǎn)物、ROA、疾病病理生理學(xué)以及動(dòng)物性別和年齡。例如，其他組織/生物流體可包括外周神經(jīng)、背根神經(jīng)節(jié)、腦脊液、玻璃體液、引流淋巴結(jié)、骨髓，和/或眼睛和視神經(jīng)。關(guān)于最終采集樣本應(yīng)以對(duì)GT產(chǎn)品、目標(biāo)臨床人群和現(xiàn)有非臨床數(shù)據(jù)的了解為指導(dǎo)。

如果預(yù)計(jì)不會(huì)出現(xiàn)全身暴露（例如，視網(wǎng)膜下給藥）或給藥部位沒有泄漏，則可以提供選擇特定組織/生物流體的理由。

還可以分析收集的樣本是否存在表達(dá)產(chǎn)物。第5.2節(jié)提供了有關(guān)該評(píng)估的考慮因素。

5、具體注意事項(xiàng)

5.1. 分析方法學(xué)

對(duì)BD概況的評(píng)估需要量化組織/生物流體中GT產(chǎn)品的遺傳物質(zhì)（DNA/RNA）的數(shù)量，如果合適，還需要量化表達(dá)產(chǎn)物。目前，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）被認(rèn)為是測(cè)量組織/生物流體中特定DNA（或者，通過反轉(zhuǎn)錄步驟，RNA）的“金標(biāo)準(zhǔn)”。核酸序列的量化對(duì)于評(píng)估GT產(chǎn)品中遺傳物質(zhì)的相對(duì)數(shù)量以及確定其累積或衰減的動(dòng)力學(xué)非常重要。應(yīng)建立并記錄定量方法的靈敏度和再現(xiàn)性限值。作為分析開發(fā)的一部分，應(yīng)進(jìn)行加標(biāo)和回收實(shí)驗(yàn)，以證明在不同組織/生物流體中檢測(cè)目標(biāo)序列的能力。其他技術(shù)可用于非臨床研究以監(jiān)測(cè)載體和/或表達(dá)產(chǎn)物的BD，包括但不限于：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）；免疫組織化學(xué)（IHC）；蛋白印跡；原位雜交（ISH）；數(shù)字PCR；流式細(xì)胞術(shù)（FCM）；各種體內(nèi)外成像技術(shù)；以及其他不斷發(fā)展的技術(shù)。重要的是提供方法的全面描述和所用技術(shù)的理由，包括方法的性能參數(shù)。

【qPCR檢測(cè)特定DNA的靈敏度最高，但目前缺少基于qPCR方法的生物分析相關(guān)指導(dǎo)原則】

5.2. 測(cè)量表達(dá)產(chǎn)物

雖然GT產(chǎn)品遺傳物質(zhì)的量化是主要的BD評(píng)估（見第5.1節(jié)），但確定不同組織/生物流體中表達(dá)產(chǎn)物的水平有助于描述給藥GT產(chǎn)品后的安全性和活性特征。有關(guān)進(jìn)行此類評(píng)估的決定應(yīng)基于GT產(chǎn)品所需的非臨床BD分析的程度，用基于風(fēng)險(xiǎn)的方法確定。該方法可包括考慮GT產(chǎn)品水平和組織/生物流體中的持續(xù)性；目標(biāo)臨床人群；以及與載體和/或表達(dá)產(chǎn)物相關(guān)的潛在安全問題。

5.3. 作為藥理學(xué)和毒理學(xué)研究組成部分的非臨床BD評(píng)估

除了獨(dú)立研究外，BD評(píng)估也可以作為非臨床藥理學(xué)和毒理學(xué)研究的一部分進(jìn)行。在這種情況下，BD評(píng)估應(yīng)遵循第4節(jié)中規(guī)定的建議。如果在單個(gè)研究中無法滿足某些建議（例如，每組動(dòng)物數(shù)量或從每只動(dòng)物收集預(yù)先確定的組織/生物流體），則應(yīng)從多個(gè)研究中獲得BD數(shù)據(jù)（見第4.4節(jié)）。

5.4. 免疫原性

動(dòng)物，尤其是非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物和其他非嚙齒類動(dòng)物對(duì)GT載體預(yù)存的免疫力可能會(huì)影響B(tài)D。在進(jìn)行非臨床研究之前，應(yīng)考慮對(duì)可能存在的載體免疫進(jìn)行篩查。理想情況下，首選經(jīng)適當(dāng)測(cè)試確定預(yù)存免疫力呈陰性的動(dòng)物，但可能并不總是可行的。在這種情況下，重要的是將這一考量納入用于將動(dòng)物隨機(jī)分組的無偏方法中。

某些情況下，由于表達(dá)產(chǎn)物的物種特異性，動(dòng)物可能對(duì)表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)或體液免疫反應(yīng)。給藥GT產(chǎn)品后，也可能發(fā)生對(duì)載體的細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)。這可能導(dǎo)致BD結(jié)果無法提供有用信息。如果預(yù)計(jì)會(huì)出現(xiàn)這種情況，申請(qǐng)人可以考慮收集和歸檔適當(dāng)?shù)臉颖荆M(jìn)行可能的免疫原性分析，以支持BD數(shù)據(jù)的解釋。

不建議僅為了評(píng)估BD而對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫抑制。然而，如果產(chǎn)品或物種特定的情況需要免疫抑制，則應(yīng)提供理由。某些情況下，也可以考慮使用物種特異性替代轉(zhuǎn)基因來規(guī)避免疫反應(yīng)的影響。

5.5. 體外轉(zhuǎn)基因細(xì)胞

體外轉(zhuǎn)基因細(xì)胞（即體外轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后給動(dòng)物/人類受試者使用）組成的GT產(chǎn)品的BD評(píng)估的注意事項(xiàng)包括細(xì)胞類型、ROA以及表達(dá)產(chǎn)物或基因修飾影響細(xì)胞在體內(nèi)預(yù)期分布的可能性等因素（例如，細(xì)胞粘附分子的新表達(dá)或改變表達(dá)）。此外，動(dòng)物發(fā)生移植物抗宿主病可能會(huì)使基因修飾人類T細(xì)胞的BD評(píng)估解釋復(fù)雜化。一般來說，基于全身給藥后預(yù)期的廣泛分布，對(duì)造血來源的體外基因修飾細(xì)胞的BD評(píng)估不重要。如果預(yù)期分布到靶器官/組織，則應(yīng)考慮BD評(píng)估。

【目前上市的6個(gè)CAR-T產(chǎn)品申報(bào)BLA所用的藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)】

5.6. 性腺組織中的BD評(píng)估

除非目標(biāo)臨床人群僅限于單一性別（例如，用于治療前列腺癌），否則必須對(duì)兩性性腺中的給藥產(chǎn)品進(jìn)行BD評(píng)估。如果載體或轉(zhuǎn)移的遺傳物質(zhì)信號(hào)通過適當(dāng)?shù)姆治龇椒ú伙@示持續(xù)性（見第4.6節(jié)和第5.1節(jié)），則可能無需進(jìn)一步評(píng)估。性腺中GT產(chǎn)品的持續(xù)存在可能導(dǎo)致進(jìn)一步的研究，以確定動(dòng)物生殖細(xì)胞（如卵母細(xì)胞、精子）中GT產(chǎn)品水平。這些數(shù)據(jù)以及其他因素（載體類型、復(fù)制能力、整合潛力、劑量水平、ROA等）可以告知意外生殖系整合的風(fēng)險(xiǎn)。有關(guān)此問題的更全面討論，請(qǐng)參閱ICH Considerations: General Principles to Address the Risk of Inadvertent Germline Inte- gration of Gene Therapy Vectors, Oct 2006。在非生殖系細(xì)胞（例如白細(xì)胞、支持細(xì)胞、睪丸間質(zhì)細(xì)胞）中檢測(cè)GT產(chǎn)品可以確保對(duì)受影響的非生殖系細(xì)胞的功能的額外考慮，尤其是當(dāng)細(xì)胞類型對(duì)成功繁殖很重要時(shí)。

5.7. 其他非臨床BD研究的觸發(fā)因素

雖然GT產(chǎn)品的非臨床BD評(píng)估是在首次人體臨床試驗(yàn)之前確定的，但以下各種情況可能會(huì)導(dǎo)致進(jìn)行額外的BD評(píng)估研究。

? 臨床開發(fā)計(jì)劃的重大變化，例如：ROA的變化；增加GT產(chǎn)品劑量水平，顯著超過所測(cè)試的最大非臨床劑量水平；給藥方案的變化；納入另一個(gè)包括兩性的臨床適應(yīng)癥，而不是最初提出的單一性別。額外的BD評(píng)估可納入任何額外的藥理學(xué)和/或毒理學(xué)研究。

? 載體結(jié)構(gòu)或血清型的顯著變化，以及可能導(dǎo)致趨性變化的任何其他修改。

? 可能影響最終GT產(chǎn)品配方（例如，添加可能改變載體趨性的輔料）或GT產(chǎn)品相關(guān)質(zhì)量屬性（例如，空衣殼比、體外基因轉(zhuǎn)移活性、產(chǎn)品效價(jià)）的制造工藝變化。關(guān)于生產(chǎn)變更，需要考慮的其他因素包括載體粒度；聚集狀態(tài)；抗原性；以及與其他宿主成分（如血清因子）的潛在相互作用。

5.8. 非臨床BD研究可能不需要或不可行的情況

從使用相同GT產(chǎn)品進(jìn)行的非臨床研究中獲得的現(xiàn)有BD數(shù)據(jù)支持不同的臨床適應(yīng)癥，可能足以滿足新的臨床人群。然而，諸如劑量水平、給藥方案、ROA和啟動(dòng)子的變化等考慮因素將納入該決定。用先前表征的GT產(chǎn)品獲得的BD數(shù)據(jù)，該GT產(chǎn)品具有相同的載體結(jié)構(gòu)和決定其組織/細(xì)胞取向的其他特征，但轉(zhuǎn)錄/翻譯產(chǎn)物不同，也可能支持豁免額外的非臨床BD研究。應(yīng)為這種方法提供理由。

某些情況下，不存在能夠獲知臨床人群中BD概況的相關(guān)動(dòng)物物種。例如，載體與人類細(xì)胞上的靶分子結(jié)合，但動(dòng)物細(xì)胞上沒有該靶分子時(shí)。在這種情況下，重要的是對(duì)問題和理由進(jìn)行全面討論，以支持評(píng)估非臨床BD的替代方法。

6、非臨床BD研究的應(yīng)用

在動(dòng)物中使用GT產(chǎn)品后的BD概況是非臨床開發(fā)計(jì)劃的關(guān)鍵組成部分。非臨床BD數(shù)據(jù)有助于全面解釋研究結(jié)果，以便更好地理解各種結(jié)果（期望的和不期望的）與使用GT產(chǎn)品的關(guān)系。將給藥動(dòng)物中觀察到的結(jié)果歸因于遺傳物質(zhì)（DNA/RNA）和/或表達(dá)產(chǎn)物，以確定潛在的益處：GT產(chǎn)品在人體給藥前的風(fēng)險(xiǎn)狀況。根據(jù)ROA、劑量水平、給藥方案和動(dòng)物免疫反應(yīng)等因素，考慮BD數(shù)據(jù)與臨床人群的相關(guān)性非常重要。這些數(shù)據(jù)還可以作為首次人體試驗(yàn)和后續(xù)臨床試驗(yàn)的信息，例如給藥程序（即受試者之間的給藥間隔）、監(jiān)測(cè)計(jì)劃和長(zhǎng)期隨訪評(píng)估。