第一代Sanger法為DNA測(cè)序打開(kāi)了大門(mén)，第代但它高昂的高通費(fèi)用限制了在大規(guī)模測(cè)序工程上的使用。當(dāng)今發(fā)展迅猛的量測(cè)第二代高通量測(cè)序設(shè)備，包括Illumina的序技Solexa、Roche 454系列以及ABI的術(shù)簡(jiǎn)SOLiD系統(tǒng)等，使測(cè)序費(fèi)用大幅降低到60-1美元/megabase。第代 它們共同的高通缺點(diǎn)是每條讀出的DNA序列太短，大致在35-250之間，量測(cè)使得后續(xù)的序技裝配工作困難重重。
現(xiàn)今，術(shù)簡(jiǎn)第三代測(cè)序設(shè)備也初露端倪。第代基于一個(gè)納米級(jí)大小微孔的高通設(shè)備在將來(lái)有可能成為高通量、廉價(jià)且能得到較長(zhǎng)DNA序列的量測(cè)單分子測(cè)序方法。納米孔嚴(yán)格限制了DNA單鏈可以通過(guò)的序技空間，每次只允許一個(gè)核苷酸按照原有的術(shù)簡(jiǎn)次序通過(guò)。DNA分子通過(guò)納米孔時(shí)，它們的序列會(huì)被逐一分辨出。整個(gè)過(guò)程無(wú)需繁瑣的增擴(kuò)、標(biāo)示步驟。
納米孔測(cè)序使用DNA合成和光學(xué)識(shí)別技術(shù)。目標(biāo)DNA被轉(zhuǎn)化為較長(zhǎng)的單鏈，每個(gè)原有的核苷酸被連續(xù)12次復(fù)制到新鏈上。經(jīng)過(guò)雜交后形成雙鏈結(jié)構(gòu)，進(jìn)入納米孔前，其中一條鏈將被剝離。可用于制作納米孔的材料比如氮化硅的厚度超過(guò)DNA分子的10-100倍，這就可能在同一時(shí)間內(nèi)有1個(gè)以上的核苷酸在隧道內(nèi)，引起互相干擾無(wú)法讀出正確的數(shù)據(jù)。因此有必要在新鏈上多次復(fù)制同一個(gè)核苷酸。
荷蘭Kavli Institute of Nanoscience開(kāi)發(fā)出厚度僅為一個(gè)原子的新材料(graphene)，是否能投入實(shí)際使用有待于進(jìn)一步檢驗(yàn)。
每個(gè)納米微孔的開(kāi)閉由離子震蕩控制，α-溶血素明確地分辨出微孔是否有DNA分子(圖二 紅色部分)。DNA鏈進(jìn)入微孔的速率由電壓調(diào)節(jié)。
核酸外切酶依附到α-溶血素的頂部(圖三B 淺藍(lán)色部分)，持續(xù)地從單鏈上切割下堿基(金色)。單個(gè)堿基通過(guò)微孔內(nèi)的氨基化環(huán)糊精(紅色)時(shí)，它們的遺傳符號(hào)(A，T，G或C)被逐一讀出。幾毫秒后，堿基穿過(guò)了整個(gè)納米孔，到達(dá)雙分子膜的另一端(圖三 A)。
橫截面的電流探測(cè)遺傳符號(hào)。核苷酸通過(guò)隧道時(shí)其自身的極性改變了原有的電磁場(chǎng)，由此探測(cè)器得知每個(gè)具體的遺傳符號(hào)(圖四)。4種核苷酸不同的結(jié)構(gòu)賦予它們不同的電子特征，這是最初納米孔測(cè)序的理論基礎(chǔ)。
除了材料方面的問(wèn)題外，納米孔測(cè)序還有下列的難題有待于解決：
1. 控制核酸外切酶精確的切割DNA分子。
2. 如何實(shí)現(xiàn)對(duì)長(zhǎng)DNA序列的測(cè)序。
3. 控制堿基在納米孔內(nèi)的移動(dòng)。
4. 納米孔的穩(wěn)定性和可靠性。
在過(guò)去的幾年里，第二代測(cè)序技術(shù)為基因研究做出了杰出的貢獻(xiàn)，但是他們普遍存在長(zhǎng)度和質(zhì)量上的缺陷。為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，數(shù)據(jù)分析和應(yīng)用帶來(lái)了不便。第三代測(cè)序技術(shù)有望克服以上的缺點(diǎn)。測(cè)序費(fèi)用的降低使得過(guò)去只有大型研究機(jī)構(gòu)才能開(kāi)展的測(cè)序工作如今也可在普通的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。技術(shù)進(jìn)步將會(huì)帶來(lái)更多的方法，推動(dòng)人類疾病治療向前發(fā)展。
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