文 | 科志康 原創 | 雙胍
2021年中，關估BioNTech和Moderna依靠mRNA疫苗實現銷售額3836%和2200%的于預疫苗有效飛速增長，mRNA平臺受到廣泛關注，防傳法規然而作為一個新興領域，染病監管部門針對mRNA藥物研發的質量指導文件不多。2021年10月，安全WHO通過Evaluation of the quality, safety and efficacy of messenger RNA vaccines for the prevention of infectious diseases: regulatory considerations，性及性評筆者整理翻譯其中對mRNA疫苗生產和控制部分，考慮供大家參考。關估
基于mRNA的于預疫苗有效疫苗代表了一種新型的生物產品，其生產方式與傳統生物制品不同。防傳法規大多數這類生物制品是染病
在基于細胞（或基于生物體）的系統中繁殖或生產的，而mRNA成分是質量通過IVT酶促生產的。mRNA疫苗作為生物制品進行監管，安全對起始材料、性及性評輔料、原液以及生產過程的充分控制和對最終產品的質量控制同樣重要。因此，需要相當重視mRNA疫苗生產過程的控制策略，以及原液和最終產品的綜合表征和放行測試。在整個生產過程中，應通過基于風險的方法對關鍵和非關鍵質量屬性（如適用）建立過程中監測和/或控制測試（可接受的限制），以便從生產開始到結束對每個批次/批號的質量進行監測。作為IND或BLA批準的一部分，放行規范和表征方法應與監管部門達成一致。
用于臨床試驗的mRNA疫苗應在適合臨床發展階段的GMP條件下制備——即，開發初始或早期階段，生產和控制程序仍在開發中，尚未得到驗證，可能無法完全遵守法規。臨床試驗材料應在滿足適當質量控制標準的基礎上放行。在緊急情況下，根據效益-風險評估，可以考慮使用未完全按照GMP制備的起始材料。需要確保生產和控制中使用的所有材料的質量和正確標識。應特別注意動物（包括人類）衍生成分的來源。還應注意確保避免或控制有相關證據和風險評估支持的潛在外來因素。生物制品質量控制的許多通用要求，如內毒素、穩定性和無菌測試，也適用于mRNA疫苗。
隨著產品開發推進，監管機構要求的詳細程度會增加。在臨床開發的初始階段，IND中包含的信息應足以評估藥品和生產過程中產生的風險。例如，這將包括工藝中使用的所有材料的鑒別和規范，生物來源材料風險評估，生產設施的GMP合規性認證或階段性認證，工藝和測試的簡要說明，擬用于臨床試驗的疫苗批次測試結果和初步穩定性測試結果。與所有疫苗一樣，對于關鍵的臨床試驗，關于mRNA疫苗質量（生產和控制）的詳細程度預計將大幅提高。關鍵臨床試驗和商業生產中使用的材料應完全符合GMP。
在臨床開發過程中進行的任何生產變更，尤其是在關鍵安全性和有效性試驗完成后在BLA前進行的生產變更，都需要進行描述和證明，與臨床批次進行對比分析，提供對產品成分（例如，mRNA序列變化、效價增強、輔料變化或防腐劑添加）或生產（例如，工藝、地點或規模的變化）所做的任何更改的詳細信息。根據最終產品成分的改變方式（例如，添加新輔料），可能需要進行新的非臨床研究。對于生產工藝的變更（如放大或凈化工藝的變更），應評估與使用先前工藝生產的原液和藥品的可比性。此類可比性研究可能基于動物模型的免疫原性數據、理化分析結果、工藝和產品相關雜質研究和/或穩定性數據。
用于BLA批準的原液和藥品放行規范和特征描述方法應涵蓋關鍵屬性，以確保提供安全有效疫苗所需的質量一致性，包括評估含量、特性、純度、效力、質量和安全屬性以及穩定性的方法。商業規范應根據在臨床研究中已證明具有可接受性能的批次的試驗結果進行定義。應說明LNP中配制的mRNA或sa mRNA疫苗的額外控制措施，包括原材料和輔料的控制措施，以及生產中間體的過程中控制措施。
mRNA疫苗的制造和控制
除了去除DNA模板、未連接的5’帽、未結合的核苷酸和酶（如RNA聚合酶），還應在可行范圍內去除所有工藝相關和產品相關的雜質（例如，dsRNA和大小不正確的mRNA分子）。還應注意去除可能參與DNA模板生成的酶，如DNA聚合酶和限制性內切酶。純化方法及其目的應予以描述和證明。任何純化過程——如用蛋白酶消化蛋白質作為雜質減少步驟——都應在適當的開發階段進行驗證。
提供生產流程圖，說明每個工藝步驟、在該工藝步驟中采集的樣本以及采集樣本的過程中控制試驗。工藝流程圖應闡明生產過程中達到原液、最終配方散裝mRNA疫苗和最終填充mRNA疫苗（藥品）階段的步驟，以及流程圖中取樣進行過程控制和放行試驗的步驟。還應說明在每個步驟中進行的測試。濃縮純化mRNA（原液）或任何中間體（如最終配方散裝mRNA疫苗）的保存時間應有穩定性研究支持。
提供有關配方和制造工藝優化的產品開發數據。例如，應考慮不同脂質的濃度、mRNA-脂質比率、緩沖液/溶劑的pH值、mRNA包封效率、脂質和mRNA的流速和混合速率，以及不同成分的解凍溫度，因為這些都會影響藥品質量。通過這種方式，可以仔細控制mRNA封裝到LNP中的過程，并對生產方法和控制措施進行充分描述和適當驗證。
對于自擴增mRNA（sa-mRNA），生產過程所需的控制措施可能與mRNA的控制措施相同或相似。但如果sa-mRNA編碼復制子的mRNA和表達靶抗原的mRNA在不同分子上，將這兩種RNA共同封裝以使它們在體內被同一細胞吸收是很重要的，需要確保所需的mRNA充分封裝在相同的LNP中，提供并證明兩種包封mRNA的摩爾比，說明驗證方法。如果這兩種RNA分別被封裝，然后混合，就需要證明這種方法的合理性。
關鍵質量控制點應包括：
a、起始材料、原料和輔料——包括但不限于：a）線性DNA模板；b）核苷酸；c）酶（例如，DNA依賴性RNA聚合酶（通常是T7 RNA聚合酶）、加帽酶、2’O-甲基轉移酶、poly(A)聚合酶、DNA酶和蛋白酶K）；d）緩沖液；e）溶劑；f）柱樹脂（柱層析用于純化）和/或g）脂質。線性DNA模板被認為是制造藥物的起始材料。其他列出的物品（以及任何未列出但也用于制造的物品）將被視為原料。輔料是指在最終藥品中作為非活性成分存在的原材料。
任何動物源性（包括人源性）原料或輔料，應通過適當的采購、控制測試和風險評估進行控制，并符合WHO guidelines on transmissible spongiform encephalopathies in relation to biological and pharmaceutical products 與生物制劑和藥品有關的傳染性海綿狀腦病指南。
避免或控制潛在的外來因素，通過相關證據和風險評估支持。
b、生產過程和中間體的過程控制——包括用于制造散裝mRNA（原液）的過程，以及配方（LNP制造和封裝步驟）、散裝最終配方和最終配方填充過程；還包括LNP配方一致性的控制或驗證、mRNA包封的一致性，以及部分mRNA和dsRNA雜質的去除。
c、mRNA原液和最終產品的放行。
d、工藝驗證——證明商業化最終產品的生產一致性，并滿足所需的質量標準
下表所示方法可被視為各種關鍵質量控制點表征或控制的可能方法示例（按潛在用途）。
疫苗結構和組成的一般信息和說明
提供描述mRNA原液和疫苗產品信息，包括設計、序列和結構、成分（例如脂質和其他輔料）以及每種輔料用量。還應提供所選輔料的原理和功能。在相關情況下，應包括有關所用脂質的結構和分子量以及它們在疫苗配方中作用的信息。
mRNA序列和元件排列
a、提供DNA模板序列。mRNA上所有元件的序列和位置或長度，包括起始密碼子、終止密碼子、側翼UTR、調節元件（例如，RNA聚合酶啟動子）和5’帽和3’poly(A)尾，以及靶抗原的開放閱讀框（ORF）。如果編碼了額外的蛋白質（如用于自擴增結構或細胞因子），則應提供其序列。描述結構中包含的任何附加序列的存在和功能。
b、由于疫苗mRNA可以含有天然存在、修飾或合成的核苷，因此序列信息應包括所使用的特定核苷。
c、此外，如果為了優化密碼子而改變了天然序列，這些改變應該被描述和證明。密碼子的改變可能有多種原因，包括更好地匹配人類細胞中適當tRNA的頻率，獲得特定的二級或三級mRNA結構，減少先天免疫反應或增加mRNA的體內穩定性。
d、如上所述，除了編碼靶抗原外，sa mRNA還編碼病毒RNA依賴性RNA聚合酶復合物（復制子），應提供此類復制子序列，并解釋其功能。通常，復制子和靶抗原存在于同一分子上，應說明和敘述每個成分的制造和控制。如果復制子與靶抗原位于不同的mRNA分子，則可能需要額外的控制，并應予以說明。
e、如果mRNA疫苗包含編碼其他免疫調節劑（如細胞因子）序列或旨在充當免疫調節的非編碼序列，應提供此類序列及其用途信息。
配方和成分
a、配方：提供用于商業生產的配方，列出單劑mRNA疫苗中每種成分的含量，確定每批總體積。如果藥品中包含一個以上的mRNA分子，應予以說明，包括不同的mRNA分子是同時封裝在單個LNP中，還是單獨封裝，隨后混合。
b、化學性質和配方：mRNA的配方主要用于提高體內穩定性和幫助細胞攝取。雖然存在幾種潛在的遞送劑（如魚精蛋白復合物、陽離子脂質體和基于脂質、聚合物或脂質/聚合物的納米粒），但目前上市的mRNA疫苗封裝在LNP中。這些配方的化學特性和結構配方（如納米顆粒）的物理特性都是必需的，并且應該解決配方和最終產品的一致性和穩定性等特性。還應考慮脂質的質量和藥品的關鍵質量屬性。應提供mRNA-LNP及其攝取到靶細胞的充分特征。這可能包括了解生成的mRNA-LNP的表面化學、大小、多分散性、形狀、電荷和蛋白結合特性，以確保實現對mRNA的充分保護和疫苗所需的穩定性。如果顯示LNP具有固有的免疫調節作用，則應提供關于潛在優缺點的相關數據。因此，應描述可能影響疫苗安全性、免疫原性和有效性的配方特征，并在配方開發過程中考慮其效果（正向或負向）。
c、其他免疫調節劑或佐劑：mRNA也可能編碼特定的免疫調節分子，如細胞因子。此外，單獨佐劑或免疫調節（刺激或抑制）化合物可添加到配方中，或者，作為LNP的一部分。應提供此類添加劑對疫苗免疫原性貢獻的證明。
d、額外的肽/蛋白質：如果包含額外的肽/蛋白質以使mRNA靶向抗原呈遞細胞或其他特定細胞類型，或增加mRNA從內體釋放，則需描述這些成分的序列和功能，并提供證據以支持其擬議的作用機制。
e、額外的輔料（如防腐劑）：應說明此類額外的輔料的成分、必要性和防腐效果（如為防腐劑），并證明不會對LNP性能產生不利影響。
起始材料、原材料和輔料的質量控制
關注生產中使用的所有材料的來源和質量。原材料應從批準的供應商處采購。按適當的材料供應商資格認證計劃進行管理。為所有原材料提供符合性證書（CoC，如適用）和分析證書（CoA）。起始材料應按照要求和規范放行，以便在隨后的GMP生產中使用。
說明起始材料、原材料和輔料，包括用于產生mRNA的材料（如DNA模板、核苷酸、酶、緩沖液、溶劑、任何純化柱等）和LNP中的脂質。提供有關其來源、質量、控制、穩定性和作用的信息，包括每種材料用于生產工藝的節點。材料應適用于GMP生產，并應提供國際公認藥典的參考資料或的詳細的規范信息。
生產LNP所使用的脂質來源和質量（尤其是LNP中以前未進行過非臨床或臨床研究的新型脂質）信息應足夠詳細，以便對其安全性和質量進行有意義的評估。提供新型脂質的生產工藝和控制細節。如果相關，應考慮對（陽離子）脂質進行亞硝胺風險評估。
應提供制造地點和制造過程的詳細信息，以及所需的過程控制和起始材料、原材料、中間體和最終輔料的規范。考慮溶劑的使用和控制，以及元素雜質污染的可能性。輔料相關的雜質水平也應得到適當控制和證明。詳細說明任何凈化和隔離步驟。為確保擬用的新型輔料的質量，其制造商應提供用于材料表征、穩定性監測和批分析方法的相關信息。由于聚乙二醇化脂質的加入在提供體內穩定性和增強LNP的細胞相互作用方面起著關鍵作用，因此應對聚乙二醇化脂質進行適當的控制（例如，分子量、多分散性和摩爾百分比）。
以質粒為起始材料的線性DNA質量
線性DNA模板被認為是mRNA疫苗GMP生產的起始材料。如果線性DNA是由質粒DNA制備的，那么建立細胞庫的程序和質粒DNA的制造應按照用于后續GMP制造的材料生產要求進行。
需建立、描述并測試細胞庫系統的微生物純度（無細菌和真菌污染）和特性。必須證明種子庫的遺傳穩定性。如果poly（A）尾編碼在質粒DNA中，那么應該特別測試DNA質粒上的該區域的重組率。純化過程也需要到位，以減少DNA質粒中的雜質（如RNA、宿主細胞DNA、蛋白質、脂質和多糖）。生產過程的設置應盡可能降低微生物污染的風險。
DNA質粒和線性DNA模板測試包括遺傳鑒定（測序）、完整性（包括確認所需的編碼抗原序列和調節/控制序列）和線性DNA百分比，以及殘余基因組DNA、RNA和蛋白質的測試（使用適當的參考標準），無菌或允許的生物負荷，以及內毒素水平。在早期開發中，檢測可能只在DNA質粒或線性DNA上進行。
在早期臨床開發中，使用質量良好的材料是可以接受的，因為預計將有更多控制來支持關鍵試驗和商業制造。
原輔料放行
為所有原材料提供符合性證書（CoC，如適用）和分析證書（CoA），并明確說明哪些測試由mRNA制造商進行，或根據原材料制造商/廠商/供應商提供的CoA接受材料。起始材料應按照要求和規范放行，以便在隨后的GMP生產中使用。
工藝開發和中間過程控制
應提供商業生產過程的開發歷史。制定并證明生產過程關鍵步驟報警和處置限制的測試和驗收標準，以確保過程控制并提供反饋。在使用成熟平臺技術的情況下，可考慮從已批準產品生產中獲得的知識。
生產工藝驗證應證明其符合其關鍵參數，并生產出一致的、符合預定義質量屬性的產品，包括證明工藝和產品相關雜質的重復性和一致性，達到預期人用可接受的水平。
初步臨床試驗中使用的候選疫苗通常不需要工藝驗證，但在臨床材料的制造過程中，應驗證或適當證明關鍵步驟，如無菌加工和藥品無菌。
產品特性
除了過程中和批量放行試驗外，還應提供mRNA（原液）和最終產品的特征總結。使用一系列正交的化學、分子、物理和生物方法進行嚴格表征至關重要。相比于每個批次都要開展的過程中和批次放行測試，表征研究和分析可以獲得有關產品結構、性能和安全性的重要知識，以指導工藝和分析測試的開發和改進，但不需要對每批產品都進行。考慮選擇用于確定各種屬性的分析方法的理由，尤其是可能使用替代技術獲得不同結果時——例如，使用不同方法進行粒度測量。因此，建議采用正交法。
確定生產的mRNA序列和正確序列的一致性程度。加帽和聚腺苷酸化過程的一致性程度也應進行表征，可能需要進行驗證。應提供表達完整編碼蛋白的證明。特別是，如果在表征研究期間證明目標抗原的截短或替代形式的表達，且這些替代形式將導致新抗原或不想要的免疫反應，那么可能需要重新設計mRNA序列。LNP中mRNA包封的一致性程度也應在表征過程中予以說明。顆粒攝取研究可以通過識別吸收顆粒的細胞類型、攝取模式或機制以及攝取效率來幫助描述潛在的效力測試，從而指導選擇最適合評估這些活性的非細胞或體外方法類型。在表征過程中，應確定這些特征是否應作為關鍵質量屬性和/或穩定性指示屬性進行控制。
表征LNP的特定方面應該非常仔細，包括通過不同分析技術確定的顆粒大小，以探索含有mRNA的LNP的形態和尺寸特征。LNP中聚乙二醇（PEG）的密度和分布信息也有助于了解mRNA-LNP的表面性質。表面電荷的測量（例如，zeta電位）應被視為表征LNP的一種方法。這些特性將影響產品的體內穩定性、細胞相互作用和免疫反應特性，也將有助于疫苗生產的一致性。
mRNA編碼的靶抗原引發的免疫原性屬于關鍵特征，應在非臨床研究中作為了解產品的一種手段進行表征。如果LNP具有固有的免疫調節作用，也應確定其特征。當mRNA中包含其他免疫調節元件或基因時，也應在非臨床研究中確定其對mRNA編碼的靶抗原的作用模式（例如，免疫原性）的貢獻，以證明其包含在特征化產品設計中的合理性。考慮這些方面對于理解和了解產品非常重要，以便優化設計和開發適當的控制方法。
描述和研究起始材料可能引入的潛在雜質，以及純化mRNA中的潛在產品或過程相關雜質。這些雜質可能包括殘余細菌宿主細胞蛋白質（如用于制造DNA模板）、內毒素、殘余細菌宿主細胞RNA和染色體DNA（如使用細菌生產）、酶（如DNA和RNA聚合酶和限制性內切酶）、未結合的核苷酸、雙鏈RNA、不完整或大小不同的RNA，以及制造過程中使用的其他材料。提供純化mRNA中存在的雜質的數據，以證明其最高可接受或最低可實現水平的規范設置合理。對于已知或潛在毒性作用的雜質和殘留物，預計將進行毒理學風險評估。降解的mRNA可作為分析的一部分進行評估，如聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳、高效液相色譜（HPLC）和/或毛細管凝膠電泳。mRNA序列和結構的一致性程度，以及在體外轉染細胞時其一致蛋白的表達，是藥物產品需要確定的重要特征。
藥物制劑中使用的脂質可能產生的任何潛在雜質（工藝和產品相關）也應進行表征和調查。這將允許對建議的規范限值進行調整，以便適當控制這些雜質，并將其控制在臨床確定的可接受范圍內。
生產一致性
與其他生物制品一樣，在BLA前，應使用經驗證的方法對多個連續批次進行測試和分析，以確定生產一致性。注意并調查一批與另一批之間在測試屬性可接受范圍之外的任何差異，結合產品和工藝知識以及對特定屬性變化的關鍵性的評估，應作為所選規范的依據。
在早期臨床開發期間，將進行少量生產，生產一致性的證明有限或不可能。隨著在產品開發過程中獲得生產經驗，證明一致性的能力將增加。批次一致性的確認通常在提交BLA前的開發晚期（例如，擴大到商業制造時）進行。無論何時變更生產工藝，都應證明批次間的可比性，尤其是與關鍵研究中使用的批次和預期商業化生產工藝中使用的批次的可比性。
