基因表達的生物示精準調控，對機體發育和細胞的醫學研究院陳運決各種生理功能的維持至關重要。基因表達的飛團紊亂，則影響著眾多的隊揭定生理和病理過程。轉錄是核生基因表達調控最關鍵的步驟，因此轉錄調控機制的物轉研究一直是分子生物學的核心課題。真核生物大多數基因的錄機錄早轉錄主要分為轉錄起始（initiation）、暫停（pausing）、器轉期命延伸（elongation）和終止（termination）四個步驟，機制每個步驟都涉及到RNA聚合酶II（Pol II）與對應的生物示轉錄起始因子、延伸因子或終止因子之間的醫學研究院陳運決相互作用和調控。
轉錄延伸因子SPT5（細菌的飛團同源蛋白為NusG/RfaH）是唯一在所有生物中都保守的轉錄調節因子。NusG/RfaH在細菌的隊揭定轉錄和翻譯的偶連中起到了重要作用，在真核生物中SPT5會與SPT4形成DSIF復合物來調控Pol II轉錄的核生延伸（transcription elongation）。有趣的物轉是，SPT5在多細胞生物中又演化出調控啟動子近端Pol II暫停（promoter-proximal Pol II pausing）的功能。
Pol II在轉錄起始后延伸到20-100 bp后暫停的現象被稱為啟動子近端Pol II暫停，這是轉錄調控的核心；該區域的穩定主要依賴于negative elongation factor (NELF)，DRB sensitivity-inducing factor (DSIF)和Pol II-associated factor 1 (PAF1)等復合物來維持。暫停的Pol II在暫停之后，會在“有效的轉錄延伸（productive release）”和“早期終止 (early termination)”兩種命運之間進行選擇。當激酶復合物p-TEFb被招募到pausing位點后，它能磷酸化Pol II CTD、DSIF和NELF，使得NELF解離；隨后暫停的Pol II被轉錄延伸因子DSIF等激活，從而進入高效的轉錄延伸階段（productive elongation）。
激酶p-TEFb可介導SPT5的第666位點絲氨酸S666和CTR1-T806的磷酸化，而Integrator-PP2A (INTAC)可能做為SPT5的磷酸酶。激酶和磷酸酶如何拮抗SPT5的磷酸化狀態以及如何精確調控核心的轉錄機器仍有待研究。
9月16日，復旦大學生物醫學研究院/附屬腫瘤醫院陳飛課題組在《分子細胞》（Molecular Cell）雜志上在線發表題為《SPT5可穩定RNA聚合酶II、協調轉錄再循環并維持增強子活性》“SPT5 stabilizes RNA polymerase II, orchestrates transcription cycles, and maintains the enhancer landscape”的研究論文。該項研究利用誘導型蛋白降解系統dTAG并結合轉錄調控高通量研究方法，發現轉錄調控因子SPT5能夠直接促進轉錄機器的蛋白質穩定性；在轉錄層面，SPT5能夠調控增強子（enhancer）活性，穩定暫停的Pol II，并促進暫停Pol II的釋放、轉錄延伸和轉錄終止。其中，SPT5第666位的絲氨酸（S666）的磷酸化特異性促進暫停Pol II的釋放，而CTR1的磷酸化特異性調控轉錄終止。同時，這兩個位點均能被磷酸酶INTAC去磷酸化，說明了SPT5介導的INTAC的功能。
ROTACs由靶蛋白配體、E3泛素連接酶配體和連接鏈三部分組成，該分子能分別識別靶蛋白和E3泛素連接酶來誘導靶蛋白的多聚泛素化，從而使靶蛋白能夠被蛋白酶體識別并降解。dTAG是一種能將CRBN泛素連接酶和FKBP12F36V連接起來的新化合物，該系統只要將FKBP12F36V與目標蛋白融合就能實現對其快速且特異的降解。
為了研究SPT5蛋白對基因轉錄直接的調控作用，該研究利用CRISPR-Cas9系統構建了FKBP12F36V-SPT5（SPT5-dTAG）細胞系，從而可以對內源SPT5蛋白進行動態調控。比較意外的是，隨著SPT5蛋白的降解，RNA 聚合酶II最大的亞基RPB1蛋白也隨之減少，并且RPB1 pSer5（與啟動子暫停pausing相關）減少的量比RPB1 pSer2（與轉錄延伸相關）的大；用ChIP-Rx也驗證了這一結果，說明細胞水平和染色質水平上的RPB1均減少。進一步研究發現RPB1蛋白的減少是通過泛素化降解途徑進行的。
PRO-seq (Precision nuclear run-on sequencing)技術是以單個堿基的分辨率檢測轉錄Pol II的定位和轉錄活性的高精度轉錄調控研究方法。利用PRO-seq技術分析SPT5蛋白快速降解的細胞系，團隊發現，基因啟動子暫停的Pol II急劇減少，基本沒看到pause release的想象；轉錄的持續性（processivity）顯著降低；在基因轉錄終止的區域有明顯的轉錄 “順讀”（transcription readthrough）。這些結果說明SPT5在維持暫停Pol II蛋白的穩定性、轉錄延伸和轉錄終止等方面有重要的調控作用。
增強子（enhancer）能通過在時空上精確的調控靶基因的表達。它的轉錄也依賴于Pol II，基于上述SPT5蛋白對mRNA基因轉錄的調控作用，促使研究人員去探究其對增強子轉錄活性的影響。通過ATAC-seq 分析發現 SPT5蛋白的缺失造成了約25%的增強子染色質的可及性（chromatin accessibility）顯著下降。通過H3K27ac，MED1和BRG1（染色質重塑復合物BAF的催化亞基）的ChIP-Rx分析，它們在增強子上的信號也減弱。以上結果說明SPT5也能調控增強子的轉錄活性。
SPT5做為最保守的轉錄調節因子，激酶p-TEFb能催化SPT5 S666和CTR1位點的磷酸化。為了回答這兩個修飾的對轉錄的調控作用，研究人員分別用這兩個突變位點的SPT5蛋白（SPT5 S666A，SPT5 CTR1-T4A）做了回補實驗。發現SPT5 S666A會使啟動子區暫停Pol II（pausing）信號增強而基因內部Pol II信號減弱，提示SPT5 S666的磷酸化可能跟Pol II的釋放（release）有關；SPT5 CTR1-T4A則讓基因轉錄終止信號提前，說明SPT5 CTR1磷酸化與轉錄終止相關。有意思的是，這兩個位點的磷酸化均能被磷酸酶INTAC去除，提示INTAC在轉錄暫停和轉錄終止這兩個階段發揮著重要的作用。
綜上所述，SPT5蛋白分別從影響增強子的轉錄活性、Pol II蛋白的穩定性、轉錄暫停（pausing）、延伸（elongation）和終止（termination）等方面來調控轉錄核心機器的運轉，為將來研究其生理病理的功能提供理論指導。
據悉，復旦大學附屬腫瘤醫院助理研究員胡士斌、博士后彭林娜和徐從玲為本文共同第一作者，博士生王振寧和宋愛霞對本文也有重要的貢獻，陳飛研究員為本文的通訊作者。TT-seq實驗得到武漢大學梁凱威教授和王紅紅同學的幫助。
值得一提的是，近日美國西北大學Ali Shilatifard課題組在《分子細胞》（Molecular Cell）雜志上在線發表題為“SPT5 stabilization of promoter-proximal RNA polymerase II”的研究論文。該研究解析了SPT5蛋白缺失后RPB1蛋白的降解機制，發現E3泛素連接酶CUL3和解折疊酶VCP是必需的。該研究與陳飛團隊第一部分的發現一致。
論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.molcel.2021.08.029
制圖：實習編輯：責任編輯：
