牛奶含有人體必需的南京微量營養(yǎng)素，對人們平衡膳食至關重要。工業(yè)高兵然而，大學打印乳糖不耐癥患者在攝入含有乳糖的何冰牛奶后，由于腸道中缺乏水解乳糖的芳教乳糖酶，會出現(xiàn)腹脹、授和腹瀉和腸胃痙攣。兵副盡管現(xiàn)在食品工業(yè)通過膜分離、教授超濾和添加游離β-半乳糖苷酶等方法實現(xiàn)了低乳糖和無乳糖牛奶的團隊生產(chǎn)，然而生產(chǎn)工藝復雜和生產(chǎn)過程中資源浪費導致其低成本效益。最新其中β-半乳糖苷酶將乳糖分水解為葡萄糖和半乳糖，南京高效水解牛奶乳糖的工業(yè)高兵同時不影響牛奶的營養(yǎng)價值。因此，大學打印一種高效，何冰操作穩(wěn)定和安全的芳教 β-半乳糖苷酶固定化方法用于低乳糖和無乳糖牛奶的生產(chǎn)具有重要意義。
為了實現(xiàn)這一目標，南京工業(yè)大學何冰芳教授團隊開發(fā)出一種3D打印β-半乳糖苷酶流動反應器用于低乳糖和無乳糖牛奶的生產(chǎn)（圖1）。通過聚乙烯亞胺和透明質(zhì)酸鈉層的層層自組裝快速修飾3D打印聚乳酸支架簡化酶固定化載體修飾過程，京尼平作為交聯(lián)劑共價固定了β-Gal保證高效、穩(wěn)定地固定酶（固定效率為 92.87%）。此外，集成到流動反應器中的3D打印支架通過定向通道擾動了不同反應器中的流體，改善了內(nèi)部傳質(zhì)，從而實現(xiàn)了高催化活性（乳糖水解效率為 94.20%）。在β-Gal流動反應器中反應 6 小時和 12 小時的牛奶乳糖殘留量分別為 1.87 g dL-1和 0.38 g dL-1，完全符合食品安全國家標準對低乳糖和無乳糖牛奶的要求。該反應器酶固定化效率高，催化活性穩(wěn)定，在低乳糖和無乳糖牛奶生產(chǎn)及其他生物催化領域具有廣闊的應用前景。
圖1 用于高效低乳糖和無乳糖牛奶生產(chǎn)的3D打印β-半乳糖苷酶流動反應器
在本研究中，研究人員制作內(nèi)部具有定向通道和孔隙的3D打印聚乳酸支架（圖2）。與傳統(tǒng)的酶固定化載體如微納米粒子、水凝膠等相比，3D打印支架可以更簡便的和流動反應器相結(jié)合而不用考慮管道堵塞和壓實的問題。此外，聚乙烯亞胺和透明質(zhì)酸鈉層層自組裝修飾3D打印支架簡化酶固定化載體修飾過程。
圖2 3D聚乳酸支架以及聚乙烯亞胺和透明質(zhì)酸鈉層層自組裝修飾過程
此外，京尼平作為一種交聯(lián)劑，目前已被廣泛研究用于高效共價連接酶分子和改性載體支架，更重要的是，它的細胞毒性比傳統(tǒng)交聯(lián)劑戊二醛低 5,000-10,000 倍。在酸性條件下，β-半乳糖苷酶的伯氨基進攻京尼平的 C3，打開二氫吡喃環(huán)，形成芳香族氨基。研究人員通過條件優(yōu)化實現(xiàn)了β-半乳糖苷酶的高效固定和穩(wěn)定的固定化酶性質(zhì)（圖3）。
圖3 固定化條件優(yōu)化和固定化酶學性質(zhì)研究
同時，研究人員將3D打印β-半乳糖苷酶支架和流動反應器相結(jié)合，通過設計不同的支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)研究流體擾動對于酶和底物傳質(zhì)影響。此外，還通過COMSOL模擬進一步研究流體在反應器內(nèi)部分布。集成到流動反應器中的3D打印支架通過定向通道擾動了不同反應器中的流體，改善了內(nèi)部傳質(zhì)，從而實現(xiàn)了高催化活性（牛奶乳糖水解效率為 94.20%）（圖4）。
圖4 3D打印β-半乳糖苷酶流動反應器的乳糖水解性能
以上成果以題目“Sustainable 3D-printed β-galactosidase Immobilization Coupled with Continuous-flow Reactor for Efficient Lactose-free Milk Production”發(fā)表在國際頂級期刊Chemical Engineering Journal雜志上（影響因子15.1）（論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2024.148557）。論文第一作者為南京工業(yè)大學藥學院碩士研究生邵云，通訊作者為南京工業(yè)大學藥學院的何冰芳教授以及高兵兵副教授。研究工作得到了國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金、江蘇省自然科學基金等項目的資助。
