11月9日，生命復旦大學生命科學學院、科學課題課題遺傳工程國家重點實驗室黃強課題組與盧大儒課題組合作的學院系統關于基因編輯系統CRISPR-Cas9的研究成果在線發表于國際知名學術期刊 《自然·通訊》(Nature Communications)。該成果用冷凍電鏡單顆粒三維重構方法解析了CRISPR-Cas9的黃強DNA剪切活性結構，在CRISPR-Cas9的組盧組DNA剪切機理研究方面取得了重要進展。

目前，大儒基于細菌獲得性免疫系統發展出的表?編輯CRISPR-Cas9技術已成為革命性的基因編輯工具，這一“基因魔剪”可以方便地對基因組DNA進行高效、基因特異性的生命切割編輯，在生物醫學領域有著巨大的科學課題課題應用潛力。為了解該系統的學院系統DNA剪切機理、指導系統的黃強優化，過去幾年，組盧組眾研究機構陸續解析了多個“Cas9-sgRNA-DNA靶鏈”的大儒三元復合物晶體結構。然而，表?編輯這些復合物結構并沒有完全揭示出真正的DNA剪切活性構象，人們對CRISPR-Cas9如何通過HNH與RuvC核酸酶域切割DNA單鏈的分子機制還很不明確。因此，獲得CRISPR-Cas9的剪切活性結構成為了揭示該系統DNA剪切機理的關鍵。

針對上述研究問題，黃強與盧大儒研究團隊早在2014年就考慮采用冷凍電鏡方法來解決。他們首先構建了釀膿鏈球菌Cas9酶 (SpCas9)、sgRNA和DNA的三元復合物，然后用冷凍電鏡單顆粒三維重構方法解析該復合物的溶液結構，獲得了一個5.2埃分辨率的冷凍電鏡結構 (圖1)。

復合物結構的原子模型顯示，在已解析的所有結構中，該復合物的HNH酶活性中心最接近DNA鏈的切割位點；分子動力學模擬及點突變實驗表明，該復合物的HNH和RuvC核酸酶活性中心的催化氨基酸可以與DNA解旋單鏈形成切割反應所需構象。因此，研究獲得的復合物結構是CRISPR-Cas9的DNA剪切激活構象，為全面揭示剪切機理提供了關鍵的活性結構信息，并為應用蛋白質工程技術優化該系統、降低其脫靶效應提供了重要的結構生物化學基礎。目前，研究團隊正在所得結構的指導下，應用蛋白質設計方法對CRISPR-Cas9系統進行優化，以開發脫靶效應低、編輯效率高的新型基因編輯系統。

圖1. SpCas9-sgRNA-DNA的復合物結構

據悉，博士研究生懷聰和碩士研究生李干為論文的并列第一作者，黃強教授與盧大儒教授為并列通訊作者。研究團隊利用國家蛋白質科學中心 (上海) 的電鏡平臺采集了冷凍電鏡圖像，并主要使用課題組自己建立的電鏡圖像分析與分子建模平臺完成了三維重構和原子模型構建工作。有關研究項目獲得了國家自然科學基金等項目支持。（封面制圖：方圓）

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