ELISPOT技術(shù)的不斷不斷發(fā)展

　　隨著ELISPOT技術(shù)的不斷發(fā)展，它的發(fā)展優(yōu)勢(shì)也漸漸顯示出來(lái)，下面將列舉ELISPOT對(duì)比其它一些傳統(tǒng)技術(shù)的不斷優(yōu)勢(shì)所在。

　　與ELISA

　　ELISA 通過(guò)顯色反應(yīng)，發(fā)展在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度，不斷與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量。發(fā)展 ELISPOT 也是不斷通過(guò)顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的發(fā)展相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點(diǎn)，可直接在顯微鏡下人工計(jì)數(shù)斑點(diǎn)或通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助的不斷分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)， 1個(gè)斑點(diǎn)代表1個(gè)細(xì)胞，發(fā)展從而計(jì)算出分泌該蛋白的不斷細(xì)胞的頻率。(某些研究不僅要測(cè)細(xì)胞因子生成量，發(fā)展還需檢測(cè)分泌此細(xì)胞因子的不斷細(xì)胞頻率) 由于是單細(xì)胞水平檢測(cè)，ELISPOT比ELISA更靈敏，發(fā)展能從20萬(wàn)-30萬(wàn)細(xì)胞中檢出1個(gè)分泌該蛋白的不斷細(xì)胞。捕獲抗體具有高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素的單抗，在研究者以刺激劑激活細(xì)胞時(shí)，不會(huì)影響活化細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。

　　與有限稀釋法(limiting dilution analysis , LDA)

　　LDA能夠?qū)μ禺愋訡TL細(xì)胞進(jìn)行定量,曾在很多年中被認(rèn)為是CTL 檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，它使人們能夠詳細(xì)了解免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和記憶毒性T淋巴細(xì)胞(memorial CTL, mCTL) 亞群的細(xì)胞周期。但該方法需要高強(qiáng)度抗原刺激, 這會(huì)加快效應(yīng)CTL(eCTL)凋亡,且不能定量測(cè)定eCTL細(xì)胞數(shù)量或測(cè)定值偏低。其次,該方法較繁瑣,培養(yǎng)時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)2～3周，而且很容易造成T細(xì)胞數(shù)量損失。

　　與四聚體法(Tetramer)

　　最近幾年出現(xiàn)了MHC2Ⅰ類(lèi)分子抗原肽四聚體法。該法的優(yōu)勢(shì)在于迅速、直接、靈敏且特異性強(qiáng),即使當(dāng)體內(nèi)mCTL水平低于1%,用MHC2Ⅰ抗原肽四聚體法仍可直接測(cè)到準(zhǔn)確的值,比LDA 敏感度要高5～10倍。但該技術(shù)也存在較多應(yīng)用上的困難：除了合成及穩(wěn)定MHCⅠ類(lèi)分子的技術(shù)困難外,最主要缺點(diǎn)是表位的選擇。由于每次反應(yīng)只能分析單一的抗原表位,而MHCⅠ類(lèi)分子結(jié)合的各種表位,能否形成CTL反應(yīng),卻隨著基因背景及時(shí)間的變化而變化,因此選擇正確的表位就顯得尤為重要。優(yōu)勢(shì)表位的篩選可以通過(guò)Elispot 來(lái)進(jìn)行,但對(duì)整個(gè)肽庫(kù)進(jìn)行掃描,并不是一件很容易的事。當(dāng)然,生物信息學(xué)的運(yùn)用對(duì)表位的篩選有很大的幫助。同時(shí),有研究結(jié)果表明,并非所有經(jīng)過(guò)Tetramer 鑒定的陽(yáng)性細(xì)胞都有確切的功能, Tetramer陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)是用ELISPOT分析能分泌INF2γ細(xì)胞數(shù)的10倍,其中很多是不表現(xiàn)功能的惰性細(xì)胞,可能代表了記憶型CTL前體細(xì)胞。Tetramer分析只增加了分析的靈敏度,同時(shí)測(cè)定其功能很重要。

　　與Cr51釋放法

　　此法是一種比較經(jīng)典的方法，雖然在檢測(cè)CTL識(shí)別的抗原多樣性方面非常有效,且能精確闡明被CTL識(shí)別的最佳表位,但至多為半定量的層面,而且Cr51標(biāo)記細(xì)胞的自發(fā)釋放率較高,不適于較長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng);標(biāo)記時(shí)所需的細(xì)胞濃度較高,因而給試驗(yàn)帶來(lái)諸多不便;此外,Cr51釋放法所測(cè)定的是一個(gè)細(xì)胞群體的特性,而不是單個(gè)細(xì)胞。

　　與胞內(nèi)CK染色法

　　與ELISPOT法相比較,胞內(nèi)CK染色法(intra-cellular CK staining,ICS) 主要應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)累積細(xì)胞因子的染色和多色參數(shù)的FACS法,是檢測(cè)循環(huán)淋巴細(xì)胞中抗原特異性T 淋巴細(xì)胞的可行方法,而ELISPOT法卻可以檢測(cè)所有分泌CK的eCTL 。

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